Какие цветные реакции на белки и аминокислоты?

Свойства белков. Цветные реакции на белки и аминокислоты

Цветные реакции имеют ключевое значение, так как они позволяют выявлять присутствие белков в биологических жидкостях и растворах, а также анализировать аминокислотный состав различных природных белков. Эти методы могут использоваться для как качественного, так и количественного определения белка и содержащихся в нем аминокислот. Некоторые из этих реакций могут также реагировать с другими веществами; к примеру, фенол может давать розово-красный цвет в реакции с реактивом Миллона, аналогично тирозину, что делает одну реакцию недостаточной для точного обнаружения белка.

Существует два основных типа цветных реакций, применяемых для определения белков и аминокислот: 1) универсальные реакции, которые включают биуретовую реакцию, обнаруживающую все белки, и нингидриновую реакцию, реагирующую с любыми α-аминокислотами и белками; 2) специфические реакции, ориентированные на определённые аминокислоты, как в составе белков, так и в растворах отдельных аминокислот. К таким реакциям можно отнести реакцию Фоля, которая выявляет аминокислоты с слабо связанным сером, реакцию Миллона, направленную на тирозин, реакцию Сакагучи, специфичную для аргинина, и другие.

Для успешного выполнения цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо заранее составить детализированную таблицу, в которой будут указаны все используемые качественные реакции на белки.

Цветные реакции на белки Опыт 1. Биуретовая реакция

Биуретовая реакция представляет собой качественный метод, который реагирует со всеми белками, а также с продуктами их неполного гидролиза, если они содержат как минимум две пептидные связи.

Механизм данного метода основан на том, что пептидные связи (-CO-NH-) в белках вступают в реакцию с сульфатом меди (II) в щелочной среде, в результате чего формируются медные комплексы, окрашенные в красно-фиолетовые оттенки. Кроме того, биуретовая реакция может наблюдаться у некоторых небелковых веществ, таких как биурет (NH2-CO-NH-CO-NH2), оксамид (NH2CO-CO-NH2) и некоторые аминокислоты, включая гистидин, серин, треонин и аспарагин.

Биуретовая реакция с глицином

Порядок выполнения анализа.

Для начала к 1 мл 1% раствора белка добавляется такой же объем 10% раствора гидроксида натрия (NaOH), а затем в смесь вводится 2-3 капли 1% раствора сульфата меди (CuSO4), который представляет собой разбавленный, почти бесцветный раствор медного купороса.

При положительном результате реакции наблюдается появление фиолетового окраса с красноватыми или синеватыми оттенками.

Опыт 2. Реакция на «слабосвязанную серу»

Принцип метода: Этот метод основывается на реакции с цистеином и цистином. При щелочном гидролизе цистеин и цистин, содержащие "слабосвязанную серу", легко теряют эту серу. В результате образуется сероводород, который при взаимодействии с щелочью превращается в сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) в раствор образуется осадок черно-серого цвета — сульфид свинца(II).

Процесс выполнения эксперимента:

В пробирку наливают 1 мл неразбавленного куриного белка и добавляют 2 мл 20%-ного раствора гидроксида натрия. Смесь аккуратно кипятят, избегая выкипания.

В процессе выделяется аммиак, который можно обнаружить по изменению цвета влажной лакмусовой бумаги, поднесенной к горловине пробирки (не касаясь стенок). Образующийся небольшой осадок растворяется при кипении. После этого в раствор добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). В результате наблюдается образование черно-серого осадка сульфида свинца(II).

Химическая суть реакции:

В небольшую пробирку помещают 1 мл неразбавленного куриного белка и добавляют 2 мл концентрированного раствора щелочи. После этого вводят несколько кипятильников. Затем к полученному горячему раствору аккуратно добавляют раствор плюмбита натрия, что приводит к образованию окраски желто-бурого или черного цвета. Для приготовления раствора плюмбита натрия следует взять 1 мл уксуснокислого свинца и медленно добавлять раствор щелочи по каплям до полного растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца.

Если в молекуле белка присутствуют серосодержащие аминокислоты, такие как цистин или цистеин, то из этих аминокислот выделяется сера в виде ионов с отрицательной степенью окисления – 2. Эти ионы серы затем реагируют с ионом свинца, образуя черный нерастворимый сульфид свинца.

Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция белков

Принцип метода. Этот метод применяется для выявления α-аминокислот с ароматическими радикалами. При взаимодействии тирозина, триптофана и фенилаланина с концентрированной азотной кислотой образуются нитропроизводные, которые имеют характерный желтый цвет. В щелочной среде эти нитропроизводные превращаются в соли, окрашенные в оранжевый оттенок. Например, желатин, который не содержит ароматических аминокислот, не реагирует в ксантопротеиновой пробе.

Порядок выполнения работы.

Добавьте 0,5 мл концентрированной азотной кислоты в 1 мл 10%-ного раствора белка куриного яйца. В результате взаимодействия образуется белый осадок или помутнение, обусловленное коагуляцией белка. При подогреве раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет, при этом осадок практически полностью растворяется из-за гидролиза. После охлаждения в раствор добавьте 1–2 мл 20%-ного раствора гидроксида натрия до тех пор, пока не появится оранжевый цвет.

Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции, используя радикал тирозина:

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Опыт 4. Реакция Адамкевича (на присутствие в белках триптофана)

Принцип данного метода основан на реакции белков, содержащих триптофан, с глиоксиловой и серной кислотами, что приводит к образованию красно-фиолетового цвета. Этот процесс основан на том, что триптофан способен взаимодействовать с альдегидами глиоксиловой кислоты в кислой среде, образуя окрашенные продукты конденсации. Реакция описывается следующим уравнением:

Желатин не реагирует в данном методе, так как он не содержит триптофан. Окрашивание возникает благодаря взаимодействию триптофана с глиоксиловой кислотой, которая всегда присутствует как примесь в концентрированной уксусной кислоте.

Аналогичную реакцию можно провести, заменив уксусную кислоту на 2,5%-ный раствор формальдегида, смешанного с концентрированной серной кислотой (H2SO4). Для этого раствор следует тщательно перемешать, а через 2-3 минуты добавить 10 капель 5%-ного раствора нитрита натрия, продолжая взбалтывание. В результате этого процесса развивается интенсивное фиолетовое окрашивание, что подтверждает принцип метода реакции.

Процедура проведения эксперимента:

В предварительно подготовленную пробирку добавляют несколько капель белка в чистом виде. Затем вливают 2 мл ледяной уксусной кислоты и несколько капель раствора глиоксиловой кислоты. Далее смесь аккуратно подогревают, чтобы осадок полностью растворился, после чего охлаждают.

Сильно наклонив пробирку, по стенке медленно вносят концентрированную серную кислоту (H2SO4), чтобы обе жидкости не смешивались между собой.

Через 5-10 минут на границе между двумя слоями можно заметить образование кольца красно-фиолетового оттенка.

Формулирование результатов эксперимента: следует сделать выводы и записать уравнение протекающей реакции.

Опыт 5. Нингидриновая реакция

Принцип метода. Взаимодействие α-аминокислот с нингидрином приводит к образованию пурпурного комплекса (пурпур Руэманна), окраска которого варьируется от синего до фиолетового. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству аминокислоты в растворе. Процесс реакции можно описать следующим образом:

Реакция с нингидрином применима для визуализации α-аминокислот на хроматограммах (как на бумажной хроматографии, так и на тонкослойной), а также для количественного анализа концентрации аминокислот путем измерения интенсивности окраски полученного продукта.

В результате этой реакции образуется продукт, содержащий радикал (R) исходной аминокислоты, который определяет различие в цвете: от голубого до красного и других оттенков, которые можно наблюдать в соединениях, формирующихся при реакции аминокислот с нингидрином.

На сегодняшний день метод нингидриновой реакции используется как для идентификации отдельных аминокислот, так и для количественного анализа их концентраций.

Процедура выполнения эксперимента.

В пробирку добавляют 1 мл разбавленного раствора белка куриного яйца с концентрацией от 1 до 10% и 1-2 мл 1%-го раствора нингидрина в ацетоне. Содержимое пробирки следует перемешать и аккуратно подогреть на водяной бане в течение 2-3 минут до появления сине-фиолетового цвета, что указывает на наличие α-аминокислот в белке.

Заключение эксперимента: составить выводы и записать уравнение реакции.

Опыт 6. Реакция Сакагучи

Принцип метода. Этот метод основан на реакции аминокислоты аргинина с α-нафтолом в присутствии окислителя. Механизм реакции до конца не раскрыт, однако предполагается, что она протекает по следующему уравнению:

Аргинин взаимодействует с α-нафтолом, и в результате образуется производное нафтохинонима. Эти производные, когда водород иминогруппы –NH– заменяется алкильной или арильной группой, окрашены в желто-красные оттенки. Таким образом, оранжево-красный цвет раствора при реакции Сакагучи вероятно обусловлен образованием производного нафтохинонима. Тем не менее, возможно образование более сложного соединения в результате дальнейшего окисления NH-групп аргининового остатка и бензольного кольца α-нафтола.

Порядок выполнения работы

К 2 мл 1%-го раствора белка куриного яйца добавляют 2 мл 10%-го раствора гидроксида натрия (NaOH) и несколько капель 0,2%-го спиртового раствора α-нафтола. Содержимое пробирки тщательно перемешивают. После этого в смесь добавляют 0,5 мл гипобромита натрия (NaBrO) или гипохлорита натрия (NaOCl) и снова перемешивают. В течение короткого времени начинается появление красного окрашивания, которое постепенно становится интенсивнее.

Для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного цвета немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины.

Специфичность реакции

Эта реакция характерна для соединений, содержащих гуанидиновые остатки:

NH = C – NH2,
NH2

и указывает на присутствие аминокислоты аргинина в белковой молекуле:

NH = C – NH – (CH2)3 – CH – COOH
NH2 NH2

Оформление опыта

Необходимо сделать выводы и записать уравнение реакции.

Ищете помощь в выполнении лабораторных работ по химии? Наши профессиональные исполнители готовы предоставить вам поддержку на любом этапе, от планирования эксперимента до анализа результатов. Мы гарантируем точность, соблюдение всех требований и сроки выполнения. Доверьтесь нашим специалистам и получите безупречный результат, соответствующий самым высоким стандартам!